體視顯微鏡通常是實驗室或生產(chǎn)現(xiàn)場“主力"。用戶需要花費數(shù)小時通過目鏡來檢查、觀察、記錄或解剖樣本。仔細(xì)評估哪些相關(guān)應(yīng)用需要用到體視顯微鏡，是確保長期滿意使用的關(guān)鍵所在。決策者們需要確保自己能夠*依照自己的需求來定制儀器。為幫助用戶能更好的選擇適合自己的體視鏡，本文介紹了幾個主要考慮的因素。

體視顯微鏡發(fā)展的歷史

1890年左右，美國生物學(xué)家和動物學(xué)家Horatio S. Greenough提出了一種光學(xué)儀器的設(shè)計原理，至今仍被所有主要制造商所采用[1-3]?；凇癎reenough原理"的體視顯微鏡可以提供高質(zhì)量的真實立體圖像。1950年代末，博士倫公司（Bausch & Lomb）推出了旗下一款帶有格林諾夫設(shè)計的體式顯微鏡，其中有一項突破性創(chuàng)新：無級（變焦）變倍[3]。幾乎所有現(xiàn)代體視顯微鏡的設(shè)計都是基于變焦系統(tǒng)。1957年，美國光學(xué)公司推出了一種立體顯微鏡，其光學(xué)原理基于望遠(yuǎn)鏡或CMO（普通主接物鏡）原理[3]。除了Greenough型外，這種體視顯微鏡由于其模塊化和高性能而很快得到所有制造商青睞。

圖1：徠卡體視顯微鏡：A) S9 Greenough系列和B-D) M205 CMO系列。

體視顯微鏡選擇前需考慮的4個問題

體視顯微鏡可以說是一項高額投資，因此選擇過程中應(yīng)當(dāng)審視奪度，認(rèn)真思考。要將顯微鏡的用途和性能發(fā)揮到j(luò)izhi，用戶應(yīng)當(dāng)考慮以下問題：

1.用途是什么？

• 是否涉及篩查和分類？

• 是否需要樣本操作

• 是否需要形成書面記錄？

2. 需要觀察、記錄或可視化哪些結(jié)構(gòu)？

• 高分辨率是否比長工作距離或其他因素更重要？

3. 有多少不同的人員需要使用顯微鏡？他們在顯微鏡上的工作時長是多少？

• 如果顯微鏡使用時間較長，請務(wù)必考慮人體工學(xué)性的配件，因為此類配件可防止出現(xiàn)重復(fù)性勞損。

• 根據(jù)不同用戶的人數(shù)，建議選用可以根據(jù)每個使用者偏好而進(jìn)行調(diào)整的顯微鏡。

4. 購置顯微鏡的可用預(yù)算是多少？

• 模塊化解決方案看起來投資更高，但從長遠(yuǎn)來看，其多功能性、適應(yīng)不同使用者的能力以及各種各樣的插件和配件，從而節(jié)省更多成本。

選擇顯微鏡時需考慮的5大關(guān)鍵因素

1. 變焦范圍、放大倍數(shù)、視場和工作距離

• 基本都在相同放大倍數(shù)下工作的使用者不需要太大的變焦范圍。

• 如果工作流程中要求進(jìn)行搜索、查找和樣本操作，就會需要從低到高可調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的較大變焦范圍。

• 在相同放大倍數(shù)之下，可觀看到的更大或更小的視場主要取決于目鏡。更大的視場，可以讓使用者更好的對樣品進(jìn)行定向觀察。

• 更大的工作距離意味著樣本頂部和物鏡前透鏡之前的距離更大，因此在使用期間能夠更加輕松地操作樣本。

2. 景深和數(shù)值孔徑（NA）

• NA越高則分辨率越高，但景深通常會有減少。

• FusionOptics技術(shù)結(jié)合高分辨率可獲得更大的景深。

3. 光學(xué)質(zhì)量

• 平場光學(xué)件：校正整個物體視場上的圖像平整度，適用于所有應(yīng)用。

• 消色差光學(xué)件：針對于色彩重現(xiàn)不是重點，而主要為了評估外形特征的應(yīng)用。

• 復(fù)消色差光學(xué)件：樣品觀察時，如果對顏色要求非常高，那就需要使用高質(zhì)量的光學(xué)件以及適當(dāng)?shù)墓庠?/p>

• 透過率：對于需要觀察樣本精密細(xì)節(jié)的應(yīng)用需求，使用具有較佳透過效果的高質(zhì)量光件會更突顯優(yōu)勢性。對于要求較高的應(yīng)用如研發(fā)用途，使用高透過率的光學(xué)件會有*不同的效果

• 色彩重現(xiàn)：如果看清樣本真實顏色是個重要指標(biāo)，則應(yīng)當(dāng)使用高質(zhì)量的光學(xué)件和恰當(dāng)?shù)恼彰鳌?/p>

4. 人體工學(xué)設(shè)計

• 人體工學(xué)配件能夠讓顯微鏡工作更加輕松并加快整個工作流程。例如，通過目鏡觀察樣本時，變焦和對焦旋鈕是否可以輕松調(diào)整？

• 如果顯微鏡交由不同的用戶操作，確?？梢愿鶕?jù)每個用戶的偏好進(jìn)行調(diào)整。

5. 照明

• 最佳照明應(yīng)當(dāng)能夠均勻照亮整個視場，帶來理想的對比度并且準(zhǔn)確揭示樣本的真實顏色。

深度解釋5大關(guān)鍵要素

1. 總放大倍數(shù)：物鏡、變焦系數(shù)和目鏡

體視顯微鏡的總放大倍數(shù)是物鏡、變焦光學(xué)系統(tǒng)和目鏡的合并的放大倍數(shù)[4]。

物鏡擁有固定的放大倍數(shù)。儀器的變焦光學(xué)件允許在變焦系數(shù)范圍內(nèi)改變放大率。目鏡也有固定的放大倍數(shù)。

為了求出通過目鏡觀察到的物體的放大倍數(shù)，必須將物鏡、變焦光學(xué)系統(tǒng)和目鏡的放大系數(shù)相乘。

總放大倍數(shù)的公式為：MTOT VIS = MO × z × ME，式中：

MTOT VIS 為總放大倍數(shù)（VIS代表“可視"）；

MO 為物鏡放大倍數(shù)（Greenough系統(tǒng)中為1x且沒有補充透鏡）；

z 為變焦系數(shù)；

ME 是目鏡的放大倍數(shù)。

一般來說，MO的數(shù)值介于0.32x和2x之間，z介于0.63x和16x之間，而ME則介于10x和40x之間。

放大倍數(shù)對視場的影響

觀察目鏡時會看到一個稱為視場的圓形區(qū)域|4|。視場的直徑取決于總放大倍數(shù)。例如，10x放大倍數(shù)的目鏡視場直徑為23。視場直徑是指在物鏡1x結(jié)合放大倍數(shù)與變焦光學(xué)之下通過目鏡所觀察到的視場為23 mm。

2. 景深：與放大倍數(shù)及分辨率的關(guān)系

景深由數(shù)值孔徑、分辨率和放大倍數(shù)之間的關(guān)系來決定[5-7]。

為了獲得樣品最佳的觀察效果，適當(dāng)調(diào)整顯微鏡的設(shè)置可以在景深和分辨率之間獲得最佳平衡。特別是在低倍率下，通過減小數(shù)值孔徑，景深可以顯著增加。因此，根據(jù)樣品特征的大小和形狀，找到分辨率和景深的最佳平衡是一個關(guān)鍵。

FusionOptics技術(shù)的高景深和高分辨率

體視顯微鏡能夠同時獲得高分辨率和高景深的精密光學(xué)方法可由徠卡顯微系統(tǒng)得到了實現(xiàn)[8]。通過一條光路，觀察者的一只眼睛可以看到高分辨率、低景深的物體圖像。同時，通過另一條光路，另一只眼睛看到同一物體的低分辨率，高景深的圖像。人腦將兩幅獨立的圖像組合成一幅最佳的整體圖像，具有高分辨率和高景深的特點。

圖2：體視顯微鏡擁有兩個獨立的光束通道（1）。在FusionOptics技術(shù)幫助下，一個光束通道提供景深（2）而另一個光束通道則提供高分辨率（3）。大腦將兩張圖像融合成一張*化的空間圖像（4）。

3. 消色差或復(fù)消色差透鏡的光學(xué)質(zhì)量

色差是一種畸變，在這種畸變中，透鏡無法將所有顏色聚焦到同一個匯聚點[2,9]。這是因為透鏡對不同波長的光具有不同的折射率（透鏡的色散）。當(dāng)光線在遠(yuǎn)離球面透鏡中心軸的點射入球面透鏡表面時，其折射程度大于或小于射入靠近球面透鏡中心點的光線時就會發(fā)生球差。好的光學(xué)設(shè)計的目的是減少或消除色差和球差。以下透鏡可用于減少這些問題產(chǎn)生的影響：

消色差透鏡

• 校正了2個波長（紅色和綠色）并讓兩者在同一平面上聚焦。

• 可見光光譜范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用。

復(fù)消色差透鏡

• 校正了3個波長（紅、綠、藍(lán)）并讓三者在同一平面上聚焦。

• 可見光光譜范圍內(nèi)高級別的應(yīng)用。

平面透鏡

• 未經(jīng)平面校正的透鏡在整個物體（視場）上顯示出不均勻的焦點。

• 建議用于需要觀察較大視場的應(yīng)用。

4. 工作距離會大幅影響顯微鏡使用性

工作距離是對焦時物鏡前透鏡和樣品頂部之間的距離。一般來說，物鏡的工作距離隨著放大倍數(shù)的增加而減小。工作距離直接影響到體視顯微鏡的使用性，特別是用于檢測和質(zhì)量控制。

5. 為獲得最佳結(jié)果的人體工學(xué)設(shè)計

一般來說，人的體型和工作習(xí)慣相當(dāng)?shù)闹匾?。因此，對裝備用于特定任務(wù)并搭配有特種配件和特定工作距離的顯微鏡，其高度（目鏡）不一定適合于所有用戶。如果觀察高度太低，觀察人員在工作時會被迫向前彎曲，導(dǎo)致頸部區(qū)域的肌肉緊張[10-12]。為補償這些高度差，建議使用可變雙目鏡筒[10]。多虧了產(chǎn)品的模塊化設(shè)計，CMO設(shè)計下的體視顯微鏡提供了許多可根據(jù)用戶體型或工作習(xí)慣來定制儀器的方法，因此是優(yōu)先的解決方案。

6. 正確照明讓一切大為不同

對于體視顯微鏡，選擇適合的照明是一大關(guān)鍵要素[13]。適當(dāng)?shù)恼彰鲗⒂兄谕ㄟ^*化的方式來對感興趣的樣本特征進(jìn)行觀察，同時有可能發(fā)現(xiàn)新的信息。對于所使用的顯微鏡和預(yù)期的應(yīng)用，請務(wù)必確保良好的照明效果。

• 反射照明

用于不透光、不透明的樣本。根據(jù)樣本的對比度和感興趣的細(xì)節(jié)給出了不同的解決方案和樣本的照明要求。參見以下參考文獻(xiàn)13 了解體視顯微鏡入射照明的一些示例。

• 透射照明

用于各種各樣的透明樣本，從生物樣本如生物模型等到聚合物和玻璃。

• 標(biāo)準(zhǔn)透射明場照明

用于所有類型的透明樣本，帶來較高的對比度和充分的顏色信息。

• 傾斜透射照明

用于幾乎透明和無色的樣本；可獲得更高的對比度和樣本的視覺清晰度。

• 暗場照明

用于觀察樣本平坦區(qū)域上的小特征，這些特征在明場中不易看到。如光澤或光亮樣本上的裂紋、氣孔、細(xì)小突起等。它還可以用來觀察尺寸低于分辨率極限的樣本結(jié)構(gòu)。

• 用于清晰透明標(biāo)片的對比法

Rottermann或浮雕對比度是一種先進(jìn)的傾斜照明技術(shù)，可以將顯示出隨著亮度的不同折射率的變化。正面浮雕對比度結(jié)構(gòu)會增強，而反面浮雕對比度結(jié)構(gòu)會降低。正、反浮雕對比可以更容易區(qū)分細(xì)微結(jié)構(gòu)，方便于從樣本中獲取最大量的信息。

了解更多：徠卡顯微

參考文獻(xiàn)
1. D. Goeggel, The History of Stereo Microscopy - Part I: 17th Century - The First Microscopes, Science Lab (2007) Leica Microsystems.
2. D. Goeggel, The History of Stereo Microscopy - Part II: The 18th Century - Greater Demands are Placed on Optics, Science Lab (2007) Leica Microsystems.
3. D. Goeggel, The History of Stereo Microscopy - Part III: The 19th Century - Breakthrough of Modern Microscope Manufacturing, Science Lab (2007) Leica Microsystems.
4. J. DeRose, M. Doppler, What Does 30,000:1 Magnification Really Mean? Some Useful Guidelines for Understanding Magnification in Today’s New Digital Microscope Era, Science Lab (2018) Leica Microsystems.
5. R. Rottermann, P. Bauer, How Sharp Images Are Formed: Depth of Field in Microscopy, Science Lab (2010) Leica Microsystems.
6. M. Wilson, Collecting Light: The Importance of Numerical Aperture in Microscopy, Science Lab (2017) Leica Microsystems.
7. M. Wilson, Microscope Resolution: Concepts, Factors and Calculation: Airy Discs, Abbe’s Diffraction Limit and the Rayleigh Criterion, Science Lab (2016) Leica Microsystems.
8. D. Goeggel, A. Schué, D. Kiper, FusionOptics - Combines high resolution and depth of field for ideal 3d optical images, Science Lab (2008) Leica Microsystems.
9. M. Wilson, Eyepieces, Objectives and Optical Aberrations, Science Lab (2017) Leica Microsystems.
10. C. Müller, How to Turn Microscope Workplaces Ergonomic, Science Lab (2017) Leica Microsystems.
11. M. Birlenbach, R. Holenstein, Higher Motivation, Longer Concentration - Ergonomics as a Competitive Advantage: Microscope Workplace Design in Quality Control, Science Lab (2013) Leica Microsystems.
12. C. Müller, J. Ludescher, Investing in Ergonomically Designed Microscope Workplaces Pays Off, Science Lab (2013) Leica Microsystems.
13. J. DeRose, M. Schacht, Illumination (Lighting) Systems for Stereo Microscopes: Obtaining the optimal results for industrial applications, Science Lab (2015) Leica Microsystems.